1
野外发病林分现场调查
操作目的：以病害野外诊断思路及方法进行野外发病林分现场初步调查
操作过程：点击“病害诊断”模块中的“野外诊断及样品采集”按钮，进入模拟的野外发病林分场景。
（1）接受普查任务，进入调查现场
系统将模拟学生接到国家林业和草原局委派的松材线虫病普查工作任务（图12）。接收任务后，学生可以在中国地图中点击代表省份标签，了解松材线虫病发病情况（图13A-E）。选中省份点击“确定”按钮后，将进入调查现场。
图12 模拟国家林业和草原局委派松材线虫病普查工作
图13A 各省份松材线虫病发生情况-江苏
图13B 各省份松材线虫病发生情况-安徽
图13C 各省份松材线虫病发生情况-湖北
图13D 各省份松材线虫病发生情况-江西
图13E 各省份松材线虫病发生情况-浙江
（2）发病林分现场的整体调查
进入调查现场后，系统将提示学生根据异常松树的外观症状，初步确定是否因松材线虫病侵染引起（图14），并告知学生此处需要掌握松材线虫病野外诊断流程与技术。学生使用“A”“W”“S”“D”按键，或鼠标实现在场景中移动，初步观察林分中各发病松树总体情况，漫游野外发病林分现场，观察林分环境、立地条件，对松林进行整体观察（图15A-B）。
图14 诊断现场的任务及目标提示
图15A 诊断现场的多角度漫游
图15B 诊断现场的多角度漫游
操作效果：对发病林分环境、立地条件、病树所处场所进行观察，掌握野外初步诊断方法。
2
松材线虫病疑似病树诊断
操作目的：掌握病害野外诊断思路及方法，通过收集发病现场病树的针叶颜色、树皮、树干、松脂分泌等信息，对松树发病原因进行初步诊断。
操作过程：学生在虚拟的病害现场中可看到表现不同症状的感病松树。
（1）发病现场的病树选择
场景中设置了健康松树（图16A）、松材线虫病致死松树（图16B）、松枯梢病感病松树（图16C）和干旱致死松树（图16D），供学生自由观察。
图16A 健康松树
图16B 松材线虫病致死松树
图16C松枯梢病感病松树
图16D干旱致死松树
（2）发病情况调查
选中某棵病树后，系统高亮提示，并弹出小框选项树体上出现“树干”、“树皮”、“当年新梢”和“针叶”按钮，学生点击后弹出小窗提供放大的细节图片，以及对应的症状特征选项。点击“树体大小”按钮后，系统切换到高视角，供学生观察所选松树的树体大小（图17A）；点击“针叶”按钮后，小窗弹出针叶的细节图片，学生仔细观察后，选择针叶的枯死顺序，以及针叶的颜色（图17B）；点击“新梢”按钮后，小窗弹出当年新梢的细节图片，学生仔细观察后，选择是否有天牛取食痕迹，以及新梢是否发病（图17C）；点击“树皮”按钮后，小窗弹出天牛产卵情况图片，学生仔细观察后，选择是否有天牛产卵刻槽（图17D）；点击“树干”按钮后，小窗弹出树脂分泌细节图片，学生仔细观察后，选择树脂分泌有无（图17E）。
图17A 松树发病情况调查（树体大小）
图17B 松树发病情况调查（针叶颜色）
图17C 松树发病情况调查（新梢被害状）
图17D 松树发病情况调查（树皮被害状）
图17E 松树发病情况调查（树脂分泌情况）
（3）初步诊断松树发病原因
疫木诊断信息采集表中将实时记录学生的具体诊选项，调查结束后，综合在虚拟病害现场对病树从整体到细部的观察，对该树发病原因进行一个初步的诊断，并在疫木诊断信息采集表中初步确认松树发病原因（图18）。评判初步病因假设是否成立，则需采集样本，带回实验室进一步进行病原物的检测验证。
图18 发现松材线虫病疑似疫木，进入采样环节
操作效果：了解病害野外诊断思路及方法，收集病树信息。全面收集感病松树的针叶颜色及其长短、树皮上有无传播媒介的产卵刻槽或羽化孔、松脂分泌情况等信息，结合环境条件，正确将松材线虫感病松树与其他原因致死松树区分开，选择正确的病树进行后续的实验操作。
3
病树样品采集
操作目的：掌握松材线虫病疫木样本采集方法
操作过程：选中病树作为采集对象后，点击“样品采集”按钮，树木右侧出现“样品采集”对话框，系统自动记录采集地点、取样时间及树木编号，学生自由选择取样部位、圆盘厚度等操作设置（图19）。
图19松材线虫病疑似疫木样品采集信息录入
确定录入的采样信息后，系统模拟手持电锯（或手摇钻或柴刀），进行规范采样（图20）。学生可以在知识角中查阅国标-松材线虫病检疫技术规程，掌握准确的采样要求（图21）。
图20 规范采样操作
图21 知识扩展（国标-松材线虫病检疫技术规程）
操作效果：根据松材线虫病疫木样本采集方法，选择合适的采样部位，采集合格的疫木样品，以便进行实验室检测，确定病害的病原物。
步骤5：疫木中线虫的分离
操作目的：了解并掌握植物寄生线虫分离的方法，掌握贝尔曼漏斗法分离线虫的原理和步骤。
操作过程：点击“疫木线虫的分离”进入线虫分离界面后，学生按照界面顶部的实验流程提示，在工具箱中选择止水夹、柴刀、三角瓶或离心管等具体工具进行实验（图22A）。
图22A 植物寄生线虫分离（贝尔曼漏斗法）的任务及目标提示
由学生模拟实际操作，将漏斗皮管夹上止水夹（图22B）；用刀具将木样处理成合适的大小（图22C），用双层纸巾包裹，放进漏斗中。加水量（图22D）、分离温度及时间（图22E）由学生自由设定。分离结束后，拖拽离心管至漏斗下部，系统将自动模拟松开止水夹，用离心管收取虫液（图22F）。
图22B 植物寄生线虫的分离（夹止水夹）
图22C 植物寄生线虫的分离（处理木样）
图22D 植物寄生线虫的分离（设置加水量）
图22E 植物寄生线虫的分离（设置分离时间和温度）
图22F 植物寄生线虫的分离（收集线虫）
操作效果：学生掌握贝尔曼漏斗法分离线虫的原理和步骤，完整按照疫木线虫的分离流程进行实验操作，设置合适的分离参数。
4
线虫分离结果检查
操作目的：建立系统、严谨的科研思维能力。通过疫木中线虫的分离结果，分析病树诊断结果、疫木分离条件的成败及原因。
操作过程：学生可以点击“分离结果”查看线虫种群变化曲线（图23），了解疫木中线虫的分离结果，并可以在小结报告中进行分析讨论。学生在步骤3中对病树的诊断、以及在步骤5中对加水量、分离温度和时间的设定将共同影响线虫分离以及后续实验的结果。
图23 线虫分离结果
操作效果：成功分离疫木，获得线虫。并且可以将松材线虫病的典型症状、松材线虫分离方法与线虫分离结果挂钩，学会分析线虫分离成败的原因，回溯检查病树诊断及分离流程。
5
线虫的形态鉴定
操作目的：掌握松材线虫的形态鉴别特征，对获得的线虫进行鉴定，准确判断疫木中是否含有松材线虫。
操作过程：疫木分离获得的线虫种类可能有多种，需对其进行种类鉴定。可以采用形态学鉴定和分子生物学手段进行鉴定。界面中显示形态鉴定工具——显微镜及分子鉴定工具——松材线虫快速检测系统（图24）。系统不强制规定学生鉴定工具的选择顺序，但根据常规鉴定流程，后台默认先形态鉴定后分子鉴定的方法最优。
图24 线虫的鉴定方法选择
由于在步骤3“松材线虫病疑似病树诊断”中有松材线虫感病松树及其他原因病树等多个采集对象供学生选择，且步骤5“疫木线虫分离”中分离参数的选择也会影响分离结果，因此学生进入形态鉴定步骤的显微镜视野中将会根据学生的不同选择，出现不同的镜检情况：
（1）在步骤3中选择正确的松材线虫致死松树进行木样采集的同学：①当步骤5选择最佳分离参数组合时，分离获得的线虫悬浮液中松材线虫浓度较高、腐生线虫较少（图25A）。
图25A 正确诊断松材线虫感病松树的学生实验界面
②步骤5中未选择最佳参数组合时，可以获得线虫但浓度很低，镜检时视野内线虫数量很少，且松材线虫比例小，腐生线虫较多（图25B）。因此看到雌、雄成虫的概率较小，需要多次吸取线虫虫液重复观察，鉴别难度加大，不影响其获得正确的结论，但实验全部完成时系统将在实验问题反馈中提示学生检查原因。
图25B 正确诊断松材线虫感病松树的学生实验界面
（1）步骤3中错误选择其他原因病树当作松材线虫致死松树采集木样的同学，无论步骤5中选项是否正确，将观察不到任何线虫，系统提醒其实验出现错误，需返回检查实验。首次实验结果将保存于后台，影响其最终实验得分（图25C）。
图25C 选择其他原因病树的学生实验界面
形态鉴定时，要求学生掌握松材线虫的典型鉴定特征，特别注意植物寄生线虫与腐生线虫的特征区别。学生点击显微镜进入模拟显微观察界面，提供4、10、20三个放大倍数（图26A），选中线虫后，点击线虫的头部（图26B）、中食道球（图26C）、阴门盖（图26D）、交合刺（图26E）和尾部形态（图26F），系统将模拟显微操作弹出高倍清晰图片，学生在右上角形态特征选项中选择自己认为的较贴切的部位描述，综合各部位特征判定松材线虫雌、雄成虫或其他线虫，切换视野可以观察更多的线虫。系统默认有5次判定机会（图27），点击“结束形态观察”按钮提交结果。
图26A 20倍放大倍数下的显微镜视野
图26B 显微镜视野下分离获得线虫的头部特征
图26C 显微镜视野下分离获得线虫的中食道球特征
图26D 显微镜视野下分离获得线虫的阴门盖特征
图26E 显微镜视野下分离获得线虫的交合刺特征
图26F 显微镜视野下分离获得线虫的尾部形态特征
图27 判定松材线虫
操作效果：根据松材线虫的形态鉴别特征，对获得的线虫进行鉴定。准确判断疫木中是否含有松材线虫，明确引发病害的病原体。
6
线虫的分子鉴定
操作目的：明确可以利用松材线虫特异性引物对线虫进行鉴定，并能够准确判读自动化分子检测结果。
操作过程：点击松材线虫自动化分子检测仪，进入的“分子鉴定”模块，模拟实际操作，将装有虫液的PCR管放入松材线虫快速检测系统中进行检测，根据属性及CT值判定形态鉴定是否准确（图28）。学生结合分子及形态鉴定结果，完成病因验证。注意，若该结论错误，即将松材线虫误判为其他线虫，会导致疫情迅速传播。
图28 线虫的分子鉴定
操作效果：根据松材线虫分子检测方法，对形态鉴定后的松材线虫进行分子鉴定，准确判读自动化分子检测结果，进一步明确引发病害的病原体。
