步骤1：松材线虫病相关知识学习

操作目的：学生在进行松材线虫病诊断及线虫致病性虚拟仿真实验前，了解松材线虫病的发生发展、流行规律等相关知识，掌握松材线虫的形态鉴别特征，以及病害诊断的核心原理——柯赫法则。

操作过程：在主页点击“病害认知”，可出现“松材线虫病发病症状”、“病原线虫形态鉴定”及“柯赫法则”三部分知识点（图6），供学生在实验开始前复习松材线虫病相关背景知识。

图6 病害认知模块包括的主要内容

（1）松材线虫病发病症状

点击“松材线虫病发病症状”按钮后，系统首先以一段视频介绍松材线虫病在我国的发展历程、发生面积和严重性（图7），学生重复学习本知识点时，也可以选择“跳过”视频。视频播放结束后将直接展示松材线虫病的发病症状，包括发病进程中松树针叶的颜色变化（图8A）、嫩枝及树皮被害状（图8B）和松脂分泌变化情况（图8C），向学生展示松材线虫病的危害及流行病学特征。

图7 松材线虫病的危害

图8A松材线虫病的发病进程

图8B松材线虫感病松树病嫩枝及树皮被害状

图8C松材线虫病感病松树树脂分泌情况

（2）松材线虫形态特征掌握

进入模拟显微状态下的“线虫形态识别”界面。学生通过点击线虫的“头部”（图9A）、“中食道球”（图9B）、“阴门盖（雌）”（图9C）、“交合刺（雄）”（图9D）和尾部等部位（图9E），观察松材线虫和腐生线虫及其他寄生线虫相应部位的形态区别，掌握松材线虫的关键鉴别特征，能够准确识别松材线虫。

图9A病原线虫头部形态特征

图9B病原线虫中食道球形态特征

图9C病原线虫雌虫阴门盖形态特征

图9D病原线虫雄虫交合刺形态特征

图9E病原线虫雌虫尾部形态特征

（3）柯赫法则理解

点击“柯赫法则”按钮，进入柯赫法则讲解界面（图10）。柯赫法则是植物病害诊断的科学方法，尤其是针对不熟悉的或新发侵染性病害，其病原物确定必须按照该法则来验证，要求学生能熟练掌握并运用。

图10 柯赫法则

（4）理论考核

学生点击“理论考核”按钮进入该步骤，系统从题库中随机抽取10道选择题进行理论考核。通过测试，了解对相关知识的掌握程度。考核成绩按比例列入实验总成绩中（图11）。

图11理论考核

操作效果：了解松材线虫病相关知识，掌握松材线虫病的发生、寄主植物、病原及传播媒介，掌握松材线虫病在我国的发生、危害及病害症状特点。

野外发病林分现场调查

操作目的：以病害野外诊断思路及方法进行野外发病林分现场初步调查

操作过程：点击“病害诊断”模块中的“野外诊断及样品采集”按钮，进入模拟的野外发病林分场景。

（1）接受普查任务，进入调查现场  

系统将模拟学生接到国家林业和草原局委派的松材线虫病普查工作任务（图12）。接收任务后，学生可以在中国地图中点击代表省份标签，了解松材线虫病发病情况（图13A-E）。选中省份点击“确定”按钮后，将进入调查现场。

图12 模拟国家林业和草原局委派松材线虫病普查工作

图13A各省份松材线虫病发生情况-江苏

图13B各省份松材线虫病发生情况-安徽

图13C 各省份松材线虫病发生情况-湖北

图13D 各省份松材线虫病发生情况-江西

图13E 各省份松材线虫病发生情况-浙江

（2）发病林分现场的整体调查

进入调查现场后，系统将提示学生根据异常松树的外观症状，初步确定是否因松材线虫病侵染引起（图14），并告知学生此处需要掌握松材线虫病野外诊断流程与技术。学生使用“A”“W”“S”“D”按键，或鼠标实现在场景中移动，初步观察林分中各发病松树总体情况，漫游野外发病林分现场，观察林分环境、立地条件，对松林进行整体观察（图15A-B）。

图14 诊断现场的任务及目标提示

图15A 诊断现场的多角度漫游

图15B 诊断现场的多角度漫游

操作效果：对发病林分环境、立地条件、病树所处场所进行观察，掌握野外初步诊断方法。

松材线虫病疑似病树诊断

操作目的：掌握病害野外诊断思路及方法，通过收集发病现场病树的针叶颜色、树皮、树干、松脂分泌等信息，对松树发病原因进行初步诊断。

操作过程：学生在虚拟的病害现场中可看到表现不同症状的感病松树。

（1）发病现场的病树选择

场景中设置了健康松树（图16A）、松材线虫病致死松树（图16B）、松枯梢病感病松树（图16C）和干旱致死松树（图16D），供学生自由观察。

图16A健康松树

图16B松材线虫病致死松树

图16C松枯梢病感病松树

图16D干旱致死松树

（2）发病情况调查

选中某棵病树后，系统高亮提示，并弹出小框选项树体上出现“树干”、“树皮”、“当年新梢”和“针叶”按钮，学生点击后弹出小窗提供放大的细节图片，以及对应的症状特征选项。点击“树体大小”按钮后，系统切换到高视角，供学生观察所选松树的树体大小（图17A）；点击“针叶”按钮后，小窗弹出针叶的细节图片，学生仔细观察后，选择针叶的枯死顺序，以及针叶的颜色（图17B）；点击“新梢”按钮后，小窗弹出当年新梢的细节图片，学生仔细观察后，选择是否有天牛取食痕迹，以及新梢是否发病（图17C）；点击“树皮”按钮后，小窗弹出天牛产卵情况图片，学生仔细观察后，选择是否有天牛产卵刻槽（图17D）；点击“树干”按钮后，小窗弹出树脂分泌细节图片，学生仔细观察后，选择树脂分泌有无（图17E）。

图17A松树发病情况调查（树体大小）

图17B 松树发病情况调查（针叶颜色）

图17C 松树发病情况调查（新梢被害状）

图17D 松树发病情况调查（树皮被害状）

图17E 松树发病情况调查（树脂分泌情况）

（3）初步诊断松树发病原因

疫木诊断信息采集表中将实时记录学生的具体诊选项，调查结束后，综合在虚拟病害现场对病树从整体到细部的观察，对该树发病原因进行一个初步的诊断，并在疫木诊断信息采集表中初步确认松树发病原因（图18）。评判初步病因假设是否成立，则需采集样本，带回实验室进一步进行病原物的检测验证。

图18 发现松材线虫病疑似疫木，进入采样环节

操作效果：了解病害野外诊断思路及方法，收集病树信息。全面收集感病松树的针叶颜色及其长短、树皮上有无传播媒介的产卵刻槽或羽化孔、松脂分泌情况等信息，结合环境条件，正确将松材线虫感病松树与其他原因致死松树区分开，选择正确的病树进行后续的实验操作。

病树样品采集

操作目的：掌握松材线虫病疫木样本采集方法

操作过程：选中病树作为采集对象后，点击“样品采集”按钮，树木右侧出现“样品采集”对话框，系统自动记录采集地点、取样时间及树木编号，学生自由选择取样部位、圆盘厚度等操作设置（图19）。

图19松材线虫病疑似疫木样品采集信息录入

确定录入的采样信息后，系统模拟手持电锯（或手摇钻或柴刀），进行规范采样（图20）。学生可以在知识角中查阅国标-松材线虫病检疫技术规程，掌握准确的采样要求（图21）。

图20 规范采样操作

图21 知识扩展（国标-松材线虫病检疫技术规程）

操作效果：根据松材线虫病疫木样本采集方法，选择合适的采样部位，采集合格的疫木样品，以便进行实验室检测，确定病害的病原物。

步骤5：疫木中线虫的分离

操作目的：了解并掌握植物寄生线虫分离的方法，掌握贝尔曼漏斗法分离线虫的原理和步骤。

操作过程：点击“疫木线虫的分离”进入线虫分离界面后，学生按照界面顶部的实验流程提示，在工具箱中选择止水夹、柴刀、三角瓶或离心管等具体工具进行实验（图22A）。

图22A植物寄生线虫分离（贝尔曼漏斗法）的任务及目标提示

由学生模拟实际操作，将漏斗皮管夹上止水夹（图22B）；用刀具将木样处理成合适的大小（图22C），用双层纸巾包裹，放进漏斗中。加水量（图22D）、分离温度及时间（图22E）由学生自由设定。分离结束后，拖拽离心管至漏斗下部，系统将自动模拟松开止水夹，用离心管收取虫液（图22F）。

图22B植物寄生线虫的分离（夹止水夹）

图22C植物寄生线虫的分离（处理木样）

图22D植物寄生线虫的分离（设置加水量）

图22E植物寄生线虫的分离（设置分离时间和温度）

图22F植物寄生线虫的分离（收集线虫）

操作效果：学生掌握贝尔曼漏斗法分离线虫的原理和步骤，完整按照疫木线虫的分离流程进行实验操作，设置合适的分离参数。

线虫分离结果检查

操作目的：建立系统、严谨的科研思维能力。通过疫木中线虫的分离结果，分析病树诊断结果、疫木分离条件的成败及原因。

操作过程：学生可以点击“分离结果”查看线虫种群变化曲线（图23），了解疫木中线虫的分离结果，并可以在小结报告中进行分析讨论。学生在步骤3中对病树的诊断、以及在步骤5中对加水量、分离温度和时间的设定将共同影响线虫分离以及后续实验的结果。

图23 线虫分离结果

操作效果：成功分离疫木，获得线虫。并且可以将松材线虫病的典型症状、松材线虫分离方法与线虫分离结果挂钩，学会分析线虫分离成败的原因，回溯检查病树诊断及分离流程。

线虫的形态鉴定

操作目的：掌握松材线虫的形态鉴别特征，对获得的线虫进行鉴定，准确判断疫木中是否含有松材线虫。

操作过程：疫木分离获得的线虫种类可能有多种，需对其进行种类鉴定。可以采用形态学鉴定和分子生物学手段进行鉴定。界面中显示形态鉴定工具——显微镜及分子鉴定工具——松材线虫快速检测系统（图24）。系统不强制规定学生鉴定工具的选择顺序，但根据常规鉴定流程，后台默认先形态鉴定后分子鉴定的方法最优。

图24 线虫的鉴定方法选择

由于在步骤3“松材线虫病疑似病树诊断”中有松材线虫感病松树及其他原因病树等多个采集对象供学生选择，且步骤5“疫木线虫分离”中分离参数的选择也会影响分离结果，因此学生进入形态鉴定步骤的显微镜视野中将会根据学生的不同选择，出现不同的镜检情况：

（1）在步骤3中选择正确的松材线虫致死松树进行木样采集的同学：①当步骤5选择最佳分离参数组合时，分离获得的线虫悬浮液中松材线虫浓度较高、腐生线虫较少（图25A）。

图25A正确诊断松材线虫感病松树的学生实验界面

②步骤5中未选择最佳参数组合时，可以获得线虫但浓度很低，镜检时视野内线虫数量很少，且松材线虫比例小，腐生线虫较多（图25B）。因此看到雌、雄成虫的概率较小，需要多次吸取线虫虫液重复观察，鉴别难度加大，不影响其获得正确的结论，但实验全部完成时系统将在实验问题反馈中提示学生检查原因。

图25B正确诊断松材线虫感病松树的学生实验界面

（1）步骤3中错误选择其他原因病树当作松材线虫致死松树采集木样的同学，无论步骤5中选项是否正确，将观察不到任何线虫，系统提醒其实验出现错误，需返回检查实验。首次实验结果将保存于后台，影响其最终实验得分（图25C）。

图25C选择其他原因病树的学生实验界面

形态鉴定时，要求学生掌握松材线虫的典型鉴定特征，特别注意植物寄生线虫与腐生线虫的特征区别。学生点击显微镜进入模拟显微观察界面，提供4、10、20三个放大倍数（图26A），选中线虫后，点击线虫的头部（图26B）、中食道球（图26C）、阴门盖（图26D）、交合刺（图26E）和尾部形态（图26F），系统将模拟显微操作弹出高倍清晰图片，学生在右上角形态特征选项中选择自己认为的较贴切的部位描述，综合各部位特征判定松材线虫雌、雄成虫或其他线虫，切换视野可以观察更多的线虫。系统默认有5次判定机会（图27），点击“结束形态观察”按钮提交结果。

图26A 20倍放大倍数下的显微镜视野

图26B显微镜视野下分离获得线虫的头部特征

图26C显微镜视野下分离获得线虫的中食道球特征

图26D显微镜视野下分离获得线虫的阴门盖特征

图26E显微镜视野下分离获得线虫的交合刺特征

图26F显微镜视野下分离获得线虫的尾部形态特征

图27 判定松材线虫

操作效果：根据松材线虫的形态鉴别特征，对获得的线虫进行鉴定。准确判断疫木中是否含有松材线虫，明确引发病害的病原体。

线虫的分子鉴定

操作目的：明确可以利用松材线虫特异性引物对线虫进行鉴定，并能够准确判读自动化分子检测结果。

操作过程：点击松材线虫自动化分子检测仪，进入的“分子鉴定”模块，模拟实际操作，将装有虫液的PCR管放入松材线虫快速检测系统中进行检测，根据属性及CT值判定形态鉴定是否准确（图28）。学生结合分子及形态鉴定结果，完成病因验证。注意，若该结论错误，即将松材线虫误判为其他线虫，会导致疫情迅速传播。

图28 线虫的分子鉴定

操作效果：根据松材线虫分子检测方法，对形态鉴定后的松材线虫进行分子鉴定，准确判读自动化分子检测结果，进一步明确引发病害的病原体。

松种感病性探究

操作目的：掌握致病性测定方法，了解寄主植物对线虫响应的差异性。引导学生正确分析实验结果，明确不同种类松树的感病性差异。

操作过程：接种环节中各参数的选择将影响到松树发病时间的长短。在固定接种温度为30℃，线虫接种浓度为5000条的情况下，由学生自由选择用于接种的松树种类，包括较为感病的黑松、马尾松以及较抗病的湿地松等（图29）。

系统将自动模拟接种，学生通过拖拉时间进度条，观察不同松树的发病进程及发病率（图30A），学生也可以点击数据记录，查看不同松树体内线虫种群数量（图30B），通过对比分析不同时间松种的发病情况，明确不同松种之间对松材线虫的抗感程度差异。

图29松种的选择

图30A不同松树接种松材线虫后的发病情况

图30B 不同松树接种松材线虫发病数据记录

操作效果：掌握致病性测定方法，正确分析实验结果，能够准确判断测试松树对松材线虫的感病性，明确不同种类松树的感病性差异。

接种浓度探究

操作目的：了解接种体密度与病害发生的关系。引导学生正确分析实验结果，明确线虫接种浓度与松材线虫病发生的关系。

操作过程：本步骤主要考核学生是否掌握线虫浓度对松树发病情况的影响。在松种固定为马尾松、接种温度固定为25℃的条件下，由学生自由设计松材线虫的接种浓度，范围在1000-10000条/株内（图31）。

图31 接种浓度的设定

接种完毕，模拟发病周期，学生观察松苗发病情况，接种量为“5000株”的同学，其接种的松树将按照常规进程发病：第10天，嫩梢针叶开始失绿；第20天，部分针叶开始变黄；第25天，大部分针叶变黄；第30天，针叶由黄变为红褐色，全株枯死，针叶不落（图32）。

图32 松树发病情况观察

要求学生根据发病进程的快慢、查看发病率及线虫数量等数据，通过对比分析不同接种浓度下松苗的发病进程及发病率（图33），找出松材线虫的最佳接种浓度。

图33 松树发病情况数据记录

操作效果：了解接种体密度与病害发生的关系，正确分析实验结果，明确判断线虫接种浓度对松材线虫病发生的影响。

环境温度探究

操作目的：了解环境温度与病害发生的关系。学生能够正确分析实验结果，明确环境温度对松材线虫病发生的影响。

操作过程：具体阐述：让学生探索接种温度对松材线虫侵染松树的影响。在松种固定为黑松、接种浓度固定为5000条的情况下，由学生自由设计接种温度（10-40℃）（图34）。

图34 接种温度设定

学生选择好接种温度后，系统将自动模拟接种，学生通过拖拉时间进度条，观察不同接种温度对松苗发病情况的影响，环境温度设置为“25℃”或“30℃”的同学，其接种的松树将按照常规进程发病：第10天，嫩梢针叶开始失绿；第20天，部分针叶开始变黄；第25天，大部分针叶变黄；第30天，针叶由黄变为红褐色，全株枯死，针叶不落。其他选项组合的松树发病时间将较常规时间延长，50天时开始观察到发病情况（图35）。学生也可以点击数据记录，查看病害发生进程及树体内及线虫种群数量等数据（图36），通过对比分析不同温度下松苗发病情况，找出最适发病温度。

图35 温度对松苗发病的影响

图36温度变化时松苗体内的线虫数量及发病率数据记录

操作效果：了解环境温度与病害发生的关系。正确分析实验结果，明确环境温度对松材线虫病发生的影响。

综合接种方案制定

操作目的：掌握多变量探究实验的研究方法，明确影响松材线虫致病性的松种（寄主植物）、线虫浓度（病原物）和环境温度（环境）三者间关系，从而深刻理解病害三角原理。

操作过程：在完成3个单变量接种探究后，学生需要比较接种结果，获得最佳的接种参数范围。进入多变量的接种方案，探讨松种、接种浓度及温度三个变量对松材线虫侵染松树的影响。本步骤主要考察学生对三个变量的设计探讨，学生制定调查时间（图37），进入松树发病情况的观察，系统模拟松树随时间发展逐渐死亡的过程（图38），同步模拟木材含水量、松苗发病率和木质部空洞化过程的变化，拖拽时间进度条可以反复查看。同时，点击每棵松树的接种点能看到某个时间点对应的树体内线虫的种群变化情况（图39A-C），发病进程结束后可查看线虫种群数量（图40）。学生还可分析“数据记录”明确线虫种群数量与发病率之间的关系，建立水分变化、木质部空洞化与松苗枯死之间的联系（图41）。

图37制定调查时间

图38发病情况模拟

图39A观察发病初期松苗中的线虫种群变化情况

图39B观察发病中期松苗中的线虫种群变化情况

图39C观察发病后期松苗中的线虫种群变化情况

图40发病过程中松材线虫种群变化

图41数据记录

操作效果：系统分析三个单变量接种方案的结果，获得各变量的合适参数，据此设计多变量接种方案，明确“病害三角”在病害发生中的关系。

综合接种方案优化

操作目的：引导并培养学生通过多次试验寻找最优方案的科学研究方法，并最终确定影响松材线虫致病性的关键参数。

操作过程：引导学生重复多次试验，结果将汇总在“记录方案”中，点击后可以直观地比较几次多因素综合设计实验的结果优劣（图42）。选择最优的综合接种方案进行提交。

图42 方案比较

操作效果：通过多次设计综合接种方案，分析松材线虫浓度、接种温度及树种三者对松树发病情况的影响，选择最优方案，明确“病害三角”在病害发生中的关系。

实验材料的无害化处理

操作目的：掌握检疫要求，对检疫性有害生物的相关实验材料进行正确管理

操作过程：考察学生对检疫性有害生物知识点的掌握。因为松材线虫是国际检疫对象，因此学生在实验结束后需根据检疫要求，模拟实际操作，对所有生物材料进行高压灭菌处理（图43）。

图43实验材料的处理

点击主页中的“实验报告”按钮，根据系统自动生成的得分表，点击查看失分原因，对答错部分提供知识点回顾及原因分析，再次巩固复习。总结实验情况，在线提交存档（图44）。

图44实验报告

操作效果：按照检疫要求对检疫性有害生物进行无害化处理。并对整个病害诊断及病原确定实验过程进行总结，明确病害发生的原因，撰写实验报告及心得体会。